Etablierung einer Methode zur qualitativen und quantitativen Erfassung einer Infektion mit Nosema ceranae auf morphologischer und genetischer Ebene

Anfang Mai bis Ende Juni

Nach einer recht langen Phase der Suche nach einem für mich interessanten Forschungsarbeiten landete ich Ende April schließlich in der Biologie in Weihenstephan. Nach einem ersten Besuch der Fakultät am 24. April erhielt ich im Gespräch mit Professor Kühn Mitte Mai einen genaueren Einblick darin was mein Thema sein würde: es sollte um das Immunsystem der Biene unter Einfluss von Pestiziden gehen. Was ich dabei untersuchen würde, teilte sich auf zwei Gebiete auf: einmal sollte ich mir ansehen, wie die Genexpression von Defensin sich verändert, zum anderen würde ich mir die veränderte Reaktion der Biene auf Nosema ansehen, einem Pilz, der sich in der Darmscheidewand ansiedelt und fortpflanzt und sie dadurch perforiert. Dazu bekomme ich Proben von Bienen, die mit pestizidverseuchtem Zuckerwasser gefüttert wurden und einer zusätzlichen Kontrollgruppe. Um die Genexpression von Defensin festzustellen, werde ich eine PCR durchführen, um die Menge an Defensin  festzustellen. Eine PCR arbeitet mit Primern, die die DNA schneiden und vervielfältigen. Diese muss ich zunächst einmal etablieren und darum habe ich bis Ende Juni gekümmert; dann stand wegen des Auslandspraktikums eine Pause an.

 

Zusammenfassung

Das Microsporidium Nosema ceranae ist ein Pathogen der Honigbiene, das hauptsächlich über Futter oder Wasser aufgenommen wird und die Mitteldarmwand perforiert. Ziel dieser Arbeit war es, eine quantitative und qualitative Methode zur Erfassung von Nosema ceranae auf morphologischer und genetischer Ebene zu etablieren.

Es wurden drei verschiedene Proben analysiert: nicht belastete und belastete Bienen sowie Referenzproben mit bekannter Sporenzahl.

Zunächst wurde der Darm der nicht belasteten und der belasteten Bienen betrachtet. Ein Schema zur Kategorisierung der Darmperforationen wurde entwickelt, das aus zwei Kategorien zur Einteilung der Größe der Löcher und drei Kategorien zur Einteilung der Anzahl der Löcher besteht. Insgesamt besteht das Schema also aus sechs Kategorien sowie einer Kategorie 0 bei keiner Perforation. Es fielen drei Phänomene auf: schwammige Randbereiche, zerfasertes Gewebe innerhalb des Darms und uncharakteristische Formen der Löcher. Das zerfaserte Gewebe wurde als einziges für die Kategorisierung berücksichtigt.

Die Genexpression von Defensin1, einem Abwehrstoff gegen Nosema ceranae, bei den nicht belasteten Bienen zeigte signifikante Schwankungen.

Die nicht belasteten Bienen wurden durch eine Standard Gradienten PCR von Am88 und Nosema ceranae auf genetischer Ebene qualitativ auf das Microsporidium getestet. Diese Methode wurde etabliert und ergab bis auf eine Probe keine Belastung mit dem Pathogen.

Eine quantitative real-time PCR für die Verdünnungsreihen der Referenzproben von Nosema ceranae wurde erstellt. Diese Methode wurde für DNA-Konzentrationen zwischen 0,625 und 5 ng/µl etabliert. Die Sporenzahlen konnten bestimmten Crossing Point-Werten zugeordnet werden.

Es wurde nachgewiesen, dass die Darmperforation mit der Nosema-Belastung korreliert, da die Proben, für die das Microsporidium nicht nachgewiesen wurde, sich in Kategorie 0 fanden. Die schwammigen Randbereiche und das zerfaserte Gewebe wurden nur bei belasteten Bienen oder bei scheinbar nicht belasteten Bienen gefunden, für die eine Infektion mit Nosema ceranae nachgewiesen wurde. Diese Phänomene werden daher vermutlich durch das Microsporidium verursacht.

Abstract

The microsporidium Nosema ceranae is a pathogen of the honeybee. It is mainly ingested through food or water and perforates the intestinal wall. The aim of this study was to establish a qualitative and quantitative method to diagnose an infection with Nosema ceranae on morphological and a genetic level.

Three different test groups were analysed: bees with and without an infection as well as DNA extractions whose spore count was known.

At first, the intestines of the bees with and without an infection were examined. A concept was developed to categorize the intestinal perforation. It consisted of two categories concerning the size and three categories concerning the number of holes. In total the scheme consisted of six different categories and another category 0 describing no intestinal perforation. Three phenomena were observed. There were spongy rim areas, uncharacteristical holes and disrupted tissue inside of the intestine. Only the disrupted tissue was taken into account for the categorization.

The not infected bee’s gene expression of defensin1, an antibody against Nosema, showed significant variances.

The bees without an infection were qualitatively tested on Nosema ceranae. Therefore a Gradient PCR of Am88 and Nosema ceranae was performed. This method was established and revealed that only one sample was infected.

A quantitative real-time PCR of Nosema ceranae was performed for the DNA extractions whose spore count was known. This method was established for DNA concentrations between 0,625 and 5 ng/µl. The spore counts could be associated to certain crossing point values.

A correlation between the intestinal perforation and the infection with Nosema ceranae was proven. The samples without detection of microsporidium belonged to category 0. The spongy rim areas and the disrupted tissue were only found within samples where the microsporidium was detected. Therefore, these phenomena might be caused by Nosema ceranae.