Klonieren einer kombinierten A/B-site-knock-out-Mutante von Roquin

Roquin ist ein Protein, das durch Regulierung von Zytokinen und Korezeptoren, die Differenzierung und Aktivierung von T-Zellen beeinflusst. Dadurch wird Autoimmunität verhindert. Es ist ein posttranskriptioneller Regulator und agiert auf der Ebene der mRNA. Die ROQ-Domäne von Roquin, ist verantwortlich für das Binden an die mRNA, diese ist in zwei Bereiche aufgeteilt, die A-site und B-site. Die A-site ist für die spezifische Bindung der cis-regulierenden RNA-Haarnadelstruktur- Regionen in der 3’UTR der mRNAs verantwortlich. Die B-site bindet unspezifische dsRNA.

In der vorliegenden Arbeit wurden schon mutierte DNA-Fragmente der ROQ-Domäne mittels Annealing-PCR miteinander verbunden. Anschließend wurde dieses Gen in Rosetta und BL21 Zellen exprimiert und mit den Proteinen wurde eine Test-IMAC durchgeführt.

Durch diesen Versuch sollte eindeutig festgelegt werden, dass nur die ROQ-Domäne von Roquin für die Bindung und Abbau der mRNA zuständig ist.