Klonierung und Testexpression einer Alkoholdehydrogenase aus Streptomyces griseus als His8-getaggtes Fusionsprotein

 

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Gen einer aus dem Bakterium Streptomyces griseus gewonnenen Alkoholdehydrogenase kloniert und als His8-getaggtes Fusionsprotein testexprimiert.

Hierfür wurde zuerst das Plasmid pHis8-TEV_S-griseus-AlcD aus dem Vektor pHis8-TEV und dem Insert, das Gen der Alkoholdehydrogenase AlcD, mithilfe eines Restriktionsverdaus von Vektor und Insert, einer Amplifikation des Inserts durch eine Polymerase-Ketten-Reaktion, einer Dephosphorylierung des Vektors, einer Aufreinigung der DNA-Fragmente und einer finalen Ligation hergestellt.

Anschließend wurde das neu entstandene Plasmid durch Hitzeschock-Transformation in Escherichia coli DH5α Zellen eingebracht und das Ergebnis der Transformation bei einer Screening PCR untersucht.

Nach dem Anlegen einer Vorkultur und der Reinigung der Plasmide wurden die Plasmide bei einem Kontrollverdau charakterisiert und anschließend auch sequenziert.

Es folgten die Anlegung und die OD-Messungen der Hauptkultur. Nach der Zellernte und der Aufreinigung der Fusionsproteine durch Nickel-Affinitätschromatographie wurde schließlich anhand der bei der Hauptkultur bzw. Aufreinigung entnommenen SDS-Proben die finale SDS-PAGE zur Analyse des entstandenen Proteins durchgeführt.